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SA-β-gal的检测方法,你了解多少?

发布时间:2021-09-16   点击次数:47次
  生衰退的变化过程。细胞衰老时,衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性会显著增加,故常常检测衰老相关半乳糖苷酶的活性以区分正常细胞与衰老细胞。目前,不同条件或化合物作用细胞后,常常用衰老相关半乳糖苷酶检测作为细胞衰老的标志之一。
 
  SA-β-gal检测方法主要分为细胞化学染色法和荧光法。
 
  一、细胞化学染色法:SA-βgal在pH6.0时,可将5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷水解,产生不溶于水的蓝色物质。这种蓝色产物相当稳定,固定干燥后避光可保存几个月。通过计算总群体中蓝色细胞的数量,可以很容易地确定SA-β-半乳糖苷酶阳性的细胞比例,即衰老细胞的比例。但是需要注意的是,在所有细胞中普遍存在酸性半乳糖苷酶,在pH4.0时发挥作用。其实SA-βgal发挥作用的最适pH为4.5,但是在pH4.5时,酸性半乳糖苷酶也会水解底物,因此需要使用SA-βgal次适pH6.0,才能确保蓝色产物是由于SA-βgal的作用而产生的。通常我们使用pH为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
 
  二、荧光法:荧光法需要借助另一种底物——C12FDG,不具有荧光,能透过细胞膜,但被βgal水解后可产生绿色荧光产物。利用流式细胞仪可检测绿色荧光的产生,藉此反映βgal的表达。因此要想检测SA-βgal的活性,需要先将溶酶体碱化至pH6.0。这一过程可使用氯喹或巴弗洛霉素A1等,可降低溶酶体的酸度,使溶酶体碱化至pH6.0。然后向细胞中加入C12FDG,孵育后制成可供流式分析细胞悬液,即可利用FC500MPL流式细胞仪等检测SA-βgal的表达。
 
  SA-β-gal细胞化学染色法通常需要半小时染色,数小时甚至一天时间等待染色完成以观察和计数,而荧光法需要4至8小时处理细胞,1天内可完成计数。前者不仅可用于细胞培养液还可用以组织切片的染色,而且所需试剂和设备简单,而后者更为高效,灵敏,定量更为准确。因此,根据实验的不同目的可选择不同的检测方法。

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